BCA法實驗原理、操作步驟

一、實驗原理

BCA(bicinchoninic acid,二辛可酸)法，測定蛋白質(zhì)即在堿性條件下蛋白質(zhì)與Cu2+絡合，并將其還原成Cu1+。Cu1+和BCA試劑反應，使其由原來的蘋果綠形成穩(wěn)定的紫藍色復合物，在562 nm有強烈的光吸收，且吸光值和蛋白質(zhì)濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關系，因此可用于蛋白質(zhì)濃度測定。

?二、操作步驟

準備標準品和樣品?：將標準蛋白質(zhì)溶液（如牛血清白蛋白BSA）稀釋成一系列已知濃度的溶液，作為標準曲線。同時，將待測樣品適當稀釋，確保其在標準曲線的線性范圍內(nèi)。

配制BCA工作液?：根據(jù)標準品和樣品數(shù)量，按照50體積的試劑A和1體積的試劑B的比例配制適量的BCA工作液。例如，如果測定4個樣品，每個樣品做3個復孔，則需要配制12份200μL的工作液。

?加樣?：在96孔板的相應孔中加入20μL的標準品或待測樣品，然后加入PBS或其他緩沖液至總體積為20μL。

?加入BCA工作液?：向每個孔中加入200μL的BCA工作液，輕輕混勻。

孵育?：將酶標板放在37℃孵育30分鐘，或者室溫下孵育2小時，使反應wanquan。

測定吸光度?：使用酶標儀在562nm波長下測定各孔的吸光度。

繪制標準曲線并計算樣品濃度?：將標準品的吸光度和對應的濃度繪制成標準曲線。然后，將待測樣品的吸光度代入標準曲線，計算出樣品的蛋白質(zhì)濃度。

三、注意事項

確保所有操作在無菌條件下進行，避免污染。

每次測定最好制作新的標準曲線，因為BCA反應可能會受溫度和時間的影響。

為保證結果的準確性，每個樣品應設置至少3個復孔，并取平均值進行計算。

注意試劑的保存條件和有效期，確保實驗的準確性。

四、蛋白濃度測定試劑盒推薦

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